作者：汪琢，姜守刚，祖元刚，付玉杰，张宇 【摘要】 目的研究紫丁香苷的体内外抗肿瘤作用。方法应用MTT法观察紫丁香苷对体外培养的4种人癌细胞的抑制作用，构建S180实体瘤小鼠模型研究紫丁香苷的体内抗肿瘤作用。结果紫丁香苷对体外培养的4种人癌细胞有一定的抑制作用，并且能抑制小鼠S180实体瘤。结论紫丁香苷具有一定的体内外抗肿瘤活性。 【关键词】 紫丁香苷; 提取分离; 抗肿瘤作用; MTT; 小鼠 刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanax Senticosus (Puper.et Maxim) Harms 的干燥根及根茎,主要分布在我国的黑龙江、吉林、河北、山西、宁夏、陕西及四川等地，朝鲜、俄罗斯远东地区及日本北海道等地亦有分布和种植[1]。刺五加具有益气健脾、补肾安神之功效, 主要用于脾肾阳虚、体虚乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多梦等病症[2]。此外，国内外对刺五加的药理作用研究还表明，刺五加可增强机体非特异性防御能力，除具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射损伤及抗疲劳等作用外，还可治疗心脑血管疾病、糖尿病、神经衰弱等症[3]。刺五加的根和茎部分含有多种活性化学成分, 到目前为止，分离出的重要成分为苷类化合物。紫丁香苷为β-谷甾醇葡萄糖苷，是一种较为典型的苷类化合物[4]，对它的研究主要集中在含量测定，而药效学研究并不多见，文献报道其有降血脂[5，6]和增强免疫力作用(张勇.《紫丁香苷的测定及其降血脂增强免疫力的研究》.2004吉林大学硕士学位论文)，对心肌缺血的保护(张迪.《刺五加皂苷单体B对大鼠急性心肌缺血的保护作用》.2006东北师范大学硕士学位论文),抗氧化[7]以及抗抑郁[8]等作用。本实验从刺五加根茎中提取分离紫丁香苷，进行了结构确认，并在此基础上对紫丁香苷进行了抗肿瘤作用研究。 1 仪器与材料 1.1 仪器CO2 培养箱, 美国SIM 公司;TS-100 倒置显微镜, 日本Nikon 公司;DL-CJ-2N 生物洁净工作台, 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司; Stat Fax-3200 酶标仪 ,美国AWARENESS 公司;1-15K高速冷冻离心机, 德国Sigma 公司;BS110 电子天平, 美国Sartorius 公司; 3102型电子天平,辽宁龙腾电子有限公司;DK-8D 型电热恒温热水槽 ,上海森信实验仪器有限公司;一次性针头式滤器, 美国Pall Life Sciences 公司;Milli-Q 超纯水系统, 美国Millpore 公司;MDF-U32V 超低温冰箱, 日本SANYO 公司;PB-21 PH 计, 美国Sartorius 公司;accu-jet 电动移液器 ,德国Brand 公司;吉尔森Gilson 移液器 ,法国Gilson 公司;LDZX-40BI 型立式自动电热压力蒸气灭菌器, 上海申安医疗器械厂;X-4数字显示显微熔点测定仪(温度未较正)，北京泰克仪器有限公司制造;旋光用WZZ-1S型数字自动旋光仪，上海浦东物理光学仪器厂;液相质谱仪 API3000 ，加拿大Applied Biosystems公司; AV-300核磁共振波谱仪(TMS内标，300 MHz)，美国Bruker公司;Waters 600 半制备液相(Waters2996二极管阵列)，美国Waters公司; HYPERSIL C18 ( 4.6 mm×150 mm 5 μm)色谱柱，美国Waters公司;RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。 1.2 药品0.9%的生理盐水,哈尔滨三联药业产品; RPMI1640培养基, 美国Hyclone 公司产品;胰蛋白酶 ，美国Gibco 公司产品;EDTA， 美国Sigma 公司产品;MTT(噻唑蓝)， 美国Sigma 公司产品;小牛血清， 天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品;96 孔培养板， 加拿大JET 公司产品;二甲基亚砜(DMSO)， 美国Amerseco 公司产品;青霉素、链霉素， 美国Hyclone 公司产品; 甲醇(色谱级、分析纯)、其他试剂均为分析纯，青岛海洋化工厂产品;环磷酰胺，江苏恒瑞制药厂产品。 1.3 动物昆明种小鼠，雄性18～22 g,由哈尔滨医科大学肿瘤医院提供;荷肉瘤S180小鼠，由哈尔滨医科大学肿瘤医院传代培养。 1.4 肿瘤细胞株人宫颈癌Hela细胞、乳腺癌MCF-7 细胞、肺癌A549 细胞和前列腺癌PC-3 细胞购于哈尔滨医科大学。 2 方法 2.1 紫丁香苷的提取分离称取刺五加干粉3 kg，过60目筛，加入甲醇回流提取3次，3 h/次，固液比分别为(1∶9，1∶8，1∶8) ,过滤,合并滤液,回收甲醇,得总浸膏。总浸膏加10倍量水超声振荡使成混悬液,用等量石油醚分别萃取3次,水层再用醋酸乙酯等体积萃取4次,弃去水层,合并醋酸乙酯层,减压浓缩干燥,得浸膏约40 g。取35 g浸膏,上硅胶柱分离,依次用氯仿- 甲醇极性递增梯度洗脱，当氯仿- 甲醇为100∶4时，洗脱得粗结晶紫丁香苷,经甲醇重结晶得紫丁香苷晶体[9]。 2.2 紫丁香苷的结构鉴定经UV,EI-MS,NMR 光谱以及其他物理化学方法鉴定为紫丁香苷。 2.3 紫丁香苷的纯度检测取紫丁香苷晶体1 mg,加5 ml色谱甲醇溶解,经0. 45 μm微孔滤膜过滤后定容于5 ml容量瓶中,即为供试液。色谱条件: 色谱柱为Zorbax Extrend C18,(416 mm ×250 mm, 5 μm);流动相为乙腈∶水 20∶80 ; 流速为1. 0 ml/min; 检测波长为265 nm;柱温为室温;进样体积为10 μl[10]。 2.4 MTT法检测紫丁香苷对4种人癌细胞增殖的体外抑制作用分别取处于指数生长期的A549，PC-3，MCF-7，Hela细胞，用含有 10%胎牛血清的 RPMI1640培养液稀释成20 000个细胞/mL， 96 孔板每孔中加入 200 μl细胞悬液，置于 37℃，5%CO2 培养箱中培养 24 h，将紫丁香苷用一定浓度的DMSO溶解，每孔中加入设定浓度紫丁香苷，稀释至需要的工作浓度。置于 37℃，5%CO2 培养箱中培养48h。MTT 用PBS配成 5 mg/ml 溶液，每孔中加入20 μl，置于37℃，5%CO2 孵箱中孵育 4 h。吸出上清，用PBS洗3次，加入150 μl DMSO 溶解沉淀物，用振荡器摇匀，酶标仪测定其OD值。 计算药物对肿瘤细胞的抑制率： 肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组OD/对照组OD)×100% 根据实验数据，由OD值计算生长抑制率，将抑制率与药物浓度做图，得出剂量反应曲线，计算出 IC50 (半数抑制浓度) 值。 2.5 紫丁香苷对小鼠实体瘤S180的抑制作用取生长旺盛的S180腹水瘤小鼠，无菌抽取腹水，用生理盐水(1∶6)稀释，制成细胞悬浮液，取0.1 ml于玻璃片上，加0.02%台朌蓝1滴，在光镜下计数，活细胞数应大于95%。取此肿瘤细胞悬液，无菌条件下接种于昆明种小鼠右腋下，每只0.2 ml，然后随机分组[11]。 取小鼠80只，按上述方法造模后，随机分为4组，分别为阳性对照组，紫丁香苷高剂量组、紫丁香苷低剂量组和空白对照组。连续小鼠尾静脉注射给药7 d,末次给药后次日处死动物，解剖取瘤，称重，计算抑瘤率，并进行统计学(t检验)处理。计算抑瘤率。 抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/模型对照组平均瘤重)×100% 3 结果 3.1 紫丁香苷的鉴定所获得的白色针状结晶经UV，EI-MS，NMR光谱分析与文献对照基本一致[12～15]，确定为紫丁香苷。分子结构如图1。 图1 紫丁香苷(syringin)的化学结构 3.2 紫丁香苷的纯度检测对所获得的紫丁香苷采用高效液相色谱法进行纯度检测(见图2)。根据面积归一化法计算，所得的紫丁香苷纯度为99.8%。 3.3 紫丁香苷对4种人癌细胞增殖的影响MTT检测结果表明紫丁香苷对4种肿瘤细胞均有明显的抑制作用,随着紫丁香苷浓度的增大肿瘤抑制率也升高,呈明显的剂量依赖性(见图3)。对4种肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50值见表1。表1 紫丁香苷对4种肿瘤细胞的IC50值μg·ml-1 3.4 紫丁香苷对小鼠肿瘤S180的抑制结果如表2所示，紫丁香苷高低剂量组S180小鼠平均瘤重均明显低于生理盐水组,抑瘤率分别为61.16%和25.89%,作用强度略小于阳性对照药环磷酰胺，抗肿瘤效果显著。 4 讨论 紫丁香苷是从中药刺五加中提取分离纯化获得的一种单体化合物。本实验对刺五加根茎进行提取和分段萃取后再利用传表2 syringin 对小鼠S180实体瘤的抑制作用 统的硅胶柱层析分离，重结晶得到白色晶体，利用UV、EI-MS、NMR 光谱等波谱技术鉴定为紫丁香苷，并用高效液相色谱测定纯度，从而确保肿瘤抑制试验的准确性。评价药物抗肿瘤效果的方法从体内和体外两个方面进行。MTT法为抗肿瘤药物筛选的常用方法,简便、高效、可重复性好，本实验选用人宫颈癌Hela细胞、乳腺癌MCF-7 细胞、肺癌A549 细胞和前列腺癌PC-3 细胞进行抗肿瘤实验，结果发现紫丁香苷对上述4种肿瘤细胞均有明显的抗肿瘤活性,IC50值分别为14.42，18.09，32.96 μg/ml和27.73 μg/ml，均呈明显的量-效关系。另外，荷瘤小鼠实验表明，紫丁香苷可以抑制实体瘤的生长，高低剂量组抑瘤率分别为61.16%和25.89%，虽然作用小于阳性对照药环磷酰胺，但安全性较高。因此,紫丁香苷临床上可用于肿瘤的防治,具有良好的开发前景。我国刺五加资源丰富，但目前主要使用刺五加混合物成分，本文对紫丁香苷的抗肿瘤活性进行研究，在开发抗肿瘤药物的同时,更充分利用了刺五加药材资源，为进一步开发利用刺五加的药用价值提供参考。 【参考文献】 [2] 张旭东，马 杰，张 彬.刺五加的药理作用研究概况[J].河北中医药学报，2007,22(3):45. 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