【关键词】 痛泻要方; 抗炎镇痛止泻; PGE2/cAMP信号通路 Abstract：ObjectiveTo study anti-inflammatory, analgesic and anti-diarrhea mechanism of Tongxie Yaofang. Methods The dimethylbenzene-caused swelling of mouse ear was used to observe the anti-inflammatory effect. Enzymelinked immunosorbent assay was used to measure the PGE2 and cAMP levels in serum of aceticacid-induced pain mice. The rhubarb-induced diarrhea was used to observe the anti-diarrhea effect. ResultsThe anti-inflammatory effect on the swelling of mouse ear caused by dimethylbenzene and the anti-diarrhea effect on the rhubarb-induced diarrhea was significant. The PGE2 and cAMP concentration in blood serum of acetic-acid-induced pain mice was significantly reduced. The delitescence of the mouse's morbus niger excretion was prolonged, and the quantity of the excretion was significantly decreased.ConclusionTongxie Yaofang has significant anti-inflammatory, antipain and anti-diarrhea effects, and PGE2/cAMP signal pathway participates in the anti-inflammatory, analgesic effects. Key words：Tongxie Yaofang; Anti-inflammatory; Antipain and anti-diarrhea; PGE2/cAMP signal path 痛泻要方是治疗痛泻之症的传统方剂，由白术、白芍、陈皮和防风组成，《丹溪心法》和《景岳全书》都有记载，具有健脾舒肝、止痛止泻的作用，主治腹痛腹泻、肠鸣腹痛、大便泄泻等。目前多用于溃疡性结肠炎和肠易激综合症的腹痛等症的治疗[1]，但其抗炎镇痛作用机制尚不清楚。有文献研究表明，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)在疼痛的发生中起着重要的作用[2，3]，而疼痛和痛觉过敏是组织损伤或炎症时常伴有的生理病理过程，谷氨酸、P物质等神经递质或神经肽以及细胞内的信号转导途径参与此过程， 3'，5'-环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是最早发现的第二信使，也是cAMP信号转导系统中的关键环节，并对某些神经递质起调节作用[4，5]。因此，本实验采用对二甲苯致小鼠耳肿胀法和生大黄致腹泻法观察痛泻要方的抗炎止泻作用，并测定冰醋酸致痛小鼠血清中PGE2和cAMP的浓度，进一步探讨痛泻要方的抗炎镇痛作用机制。 1 材料与仪器 1.1 动物与分组 SPF级NIH小鼠，体质量18～22 g，动物合格证号2008A023，购自广东省医学实验动物中心。随机分为5组：模型对照组，阳性对照组(盐酸小檗碱)，痛泻要方低、中、高剂量组(11.8，23.6，47.2 g生药量·kg-1;相当与成人2，4，8倍等效剂量)。 1.2 试药与仪器 痛泻要方实验用白术、白芍、陈皮和防风购自广州致信中药饮片有限公司(批号：080605)，按处方比例称取药材一定量，煮沸30 min后过滤上清液，用水浴浓缩到所需浓度。盐酸小檗碱，广州市市桥药业有限公司产品，批号080711。生理盐水，四川科伦药业股份有限公司产品，批号T080712B。冰醋酸，广州化学试剂厂产品，批号071102-24。PGE2试剂盒购自上海太阳生物技术公司，cAMP试剂盒购自美国 R&D systems公司。SunRise酶标仪(奥地利Sunrise公司)，TG16-WS台式高速离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)，ZD-85恒温振荡器(常州国华电器有限公司)，BP211D型电子分析天平。 2 方法 2.1 痛泻要方对二甲苯致小鼠耳肿胀的作用[6，7]将小鼠50只随机分为5组(每组10只)：模型对照组、痛泻要方低、中、高剂量组、盐酸小檗碱组。各组连续灌胃给药7 d，1次/d，模型组给予等体积的生理盐水。末次给药1 h后，将二甲苯0.03 ml均匀涂于小鼠右耳，2 h后处死，用直径8 mm的打孔器将左右两耳廓相同部位等面积取下两圆耳片，用电子天平准确称出质量，以左右耳重量之差作为肿胀度，计算肿胀抑制率。 2.2 痛泻要方对冰醋酸致痛小鼠镇痛作用[8，9]及血清中PGE2、cAMP的测定 将小鼠50只随机分为5组(每组10只)：模型对照组，痛泻要方低、中、高剂量组，盐酸小檗碱组。各组连续灌胃给药7 d，1次/d，模型对照组给予等体积的生理盐水。末次给药后1 h后腹腔注射0.6%冰醋酸溶液，每只10 mg·kg-1。观察记录15 min内发生扭体反应(腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起)的次数，观察后立刻小鼠眼球后静脉丛采血，用酶联免疫法按试剂盒操作说明测定血清中PGE2(ng·L-1)、cAMP(nmol·L-1)的含量。 2.3 痛泻要方对大黄致泻的作用[10]将小鼠50只随机分为5组(每组10只)：模型对照组、痛泻要方低、中、高剂量组、盐酸小檗碱组。各组连续灌胃给药7 d，1次/d，模型对照组给予等体积的生理盐水。末次给药前禁食12 h，于末次给药后1 h，各组小鼠每只灌服生大黄水提液(1 g·ml-1，含活性碳末0.1 g·ml-1)0.5 ml，记录6 h内带有碳末的湿粪便个数，作为初期腹泻排泄指标，以灌服生大黄水提液后到第1次碳末腹泻物出现的时间为腹泻的潜伏期。 2.4 统计方法 各组实验数据均用±s表示，应用SPSS11.0软件包单因素方差分析法进行各组件比较。 3 结果 3.1 痛泻要方对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 由表1可知，痛泻要方低、中、高剂量组可以降低小鼠耳廓平均肿胀度，与模型组相比，有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，盐酸小檗碱组耳廓平均肿胀度与模型组相比，有显著性差异(P<0.01)。表1 对二甲苯致小鼠耳肿的影响与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01;n=10 3.2 痛泻要方对冰醋酸致痛小鼠镇痛及血清中PGE2、cAMP的影响 由表2可知，痛泻要方组随剂量增加，小鼠扭体次数逐渐减少，盐酸小檗碱组、痛泻要方低、中、高剂量组与模型对照组比较，有显著性差异(P<0.05)。冰醋酸致痛小鼠血清中PGE2、cAMP浓度明显增加;与模型组比较，盐酸小檗碱组及痛泻要方低、中、高剂量组PGE2、cAMP浓度明显减少(P<0.05或P<0.01);与盐酸小檗碱组比较，痛泻要方高剂量组PGE2、cAMP浓度亦呈减少(P<0.05)。表2 对冰醋酸致痛小鼠镇痛作用及血清中PGE2、cAMP的影响与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01;与盐酸小檗碱组比较，#P<0.05;n=10 3.3 痛泻要方对大黄致泻的影响 由表3可知，痛泻要方高剂量组能明显延长小鼠排黑粪的潜伏期，与模型对照组比较，有显著性差异(P<0.05)。盐酸小檗碱组、痛泻要方低、中、高剂量组能明显减少黑粪排出数量，与模型对照组比较，有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。表3 对生大黄水提液所致小鼠腹泻的影响与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01;n=10 4 讨论 痛泻要方具有良好的抗炎作用，能使小鼠耳廓肿胀度显著减轻，对二甲苯致小鼠耳肿有显著抑制作用，其抗炎作用呈较明显的量效关系，高剂量可明显抑制小鼠耳廓肿胀，抑制率较高，与阳性药抑制率接近，中、低剂量抑制作用较弱。 痛泻要方能显著抑制醋酸所致小鼠扭体反应，具有很强的镇痛作用，PGE2在疼痛的发生中起着重要的作用，组织在受到损伤和炎症时局部可释放出PGE2、组胺和白三烯等炎性致痛物质而引起疼痛。而且PGE2既可直接刺激神经末梢引起疼痛，提高痛觉感受器对其它致痛因子的敏感性，也可启动疼痛所介导的信号转导通路[2，3]。有文献表明，cAMP可引起感觉神经元过度兴奋和痛觉过敏[4];对于长期吸食阿片类成瘾者停药期间发生的痛觉过敏也是由于cAMP升高所导致的[5]。因此，本实验将0.6%冰醋酸给予小鼠腹腔注射后，通过测定小鼠血清中PGE2和cAMP的浓度，以观察各剂量痛泻要方产生的镇痛作用是否与PGE2/cAMP信号通路变化有关。结果表明模型对照组小鼠血清中PGE2和cAMP浓度明显增加;盐酸小檗碱组及痛泻要方低、中、高剂量组PGE2、cAMP浓度与模型组比较明显减少;与盐酸小檗碱组比较，痛泻要方高剂量组PGE2、cAMP浓度亦呈减少。由此可知，较大剂量痛泻要方产生的镇痛作用可能与降低血清中的PGE2，减轻冰醋酸刺激局部组织产生的炎症反应，减少内源性致痛物质的产生;同时又减少痛觉感觉神经细胞产生第二信使cAMP，提高对痛觉的耐受性，减少痛觉敏感化及痛觉冲动的上传而发挥镇痛作用有关。因此，PGE2/cAMP信号通路可能参与了痛泻要方的镇痛作用。 痛泻要方主要由白术、白芍、陈皮和防风组成，其中防风专入肝脾，舒脾升阳，助白术以止泻。实验中采用灌服生大黄水提液可导致脾失健运，以致腹泻。痛泻要方高剂量组能明显延长小鼠排黑粪的潜伏期，低、中、高剂量组能明显减少黑粪排出数量，具有一定的止泻作用。 【参考文献】 [2] Flodgren GM,Crenshaw AG,Alfredson H,et a1.Glutamate and prostaglandin E2 in the trapezius muscle of female subjects with chronic muscle pain and controls determined by microdialysis[J].Eur J Pain,2005，9(5):511. [3] Heinricher MM,Martenson ME,Neubert MJ.Prostaglandin E2 in the midbrain periaqueductal gray produces hyperalgesia and activates pain-modulating circuitry in the rostral ventromedial medulla[J].Pain,2004:(1～2):419. [4] Song XJ,Wang ZB,Gan Q,et a1.cAMP and cGMP contribute to sensory,neuron hyperexcitability and hyperalgesia in rats with dorsal root ganglia compression[J].J Neurophysiol,2006，95(1):479. [5] Bie B,Peng Y,Zhang Y,et a1.cAMP-mediated mechanisms for pain sensitization during opioid withdrawa1[J].J Neurosci,2005,25(15):3824. [6] 黄可儿，柯雪红，王丽新，等. 肠炎灵片挥发油对胃肠功能的影响[J]. 广西中医药，2003，26(5)：48. [7] 黄光荣，李 翎. 肠炎灵片的药效学研究[J]. 湖南中医杂志，2005，21(6)：69. [8] 徐玉红，李 东，万于军,等. 痛风方剂颗粒镇痛抗炎作用的实验研究[J]. 中国药师，2007，10(11)：1053. [9] 刘晋华，屈梅芳，尤光甫. 祛风活络丸抗炎镇痛作用的实验研究[J]. 中国药师，2005，8(9)：719. [10] 谭晓梅，龙 群. 香连丸有效部位镇痛、止泻、抗炎及小肠推进的药效学研究[J]. 南方医科大学学报，2008，28(3)：499. LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2010 VOL .21 NO.3时珍国医国药2010年第21卷第3期
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